膠乳凝集試驗
膠乳固定試驗，又稱為膠乳凝集試驗（latex agglutination tests，LAT或者latex immunoagglutination assays，LIA），臨床上用於許多重要微生物的鑑定和分型。這些測試利用患者的抗原-抗體免疫反應。當檢測到病原體時，機體針對病原體表面存在的已識別抗原（蛋白質構型）形成特異性抗體時發生。
通過在膠乳塑料微珠上塗覆病原體特異性的抗原或抗體，可設計臨床針對多種病原體的凝集試劑。測試時，實驗室臨床醫生將患者的腦脊液、血清或尿液與帶塗層膠乳顆粒的連續稀釋液與生理鹽水（對避免鈎子效應很重要）混合，並觀察凝集。任何珠子凝集都被認為是陽性結果，確認患者的身體已經產生了病原體特異性抗體（如果測試提供抗原）或樣本含有病原體的抗原（如果測試提供病原體抗體）。如產生交叉反應（抗體沒有結合感興趣的抗原，而是結合了另一種抗原）可能會導致誤診。
原理
[編輯]定性
[編輯]通過光散射測量監測抗原抗體反應自19世紀20年代以來就已為人所知。抗原（Ag）與抗體（Ab）形成免疫複合物再形成沉澱，需要反應多價抗原與二價（或多價複合）抗體的組合，聚集體足夠大則可以通過光學檢測分析。而如果抗原或抗體分子連接到合適的顆粒，例如聚合物顆粒（膠乳）可以增強檢測靈敏度。
定量
[編輯]抗原特異性抗體所包被的乳膠微粒在抗原存在時發生凝集，其凝集程度與抗原濃度成正比，通過對透射光或散射光的測量可進行定量分析，當乳膠增強用於散射比濁法（Nephelometry）或透射比濁法（Turbidimetry）時，靈敏度相比單純的抗原抗體凝集，信號可增強兩到三個數量級。[1][2]另外也可通過准彈性光散射、角度不對稱或粒子計數等進行定量。[3]
抗體修飾膠乳的製備
[編輯]抗體修飾
[編輯]膠乳表面抗體的修飾可分為物理吸附與化學偶聯。理想的抗體固定化有三個特點，分別是：
- 抗體牢固地結合在基質上（例如共價連接），降低長期檢測和分析過程中脫落的可能；
- 抗體以高度可控和位點特異性的方式固定，明確的方向可以避免假陰性並保證更低的檢測極限（LOD）；
- 抗體偶聯後，最終的支撐物應完全惰性，以避免假陽性。[4]
四種主要抗體偶聯取向包括：尾接（tail-on）、頭接（head-on）、側接（side-on）、平接（flat-on）。[5]
小鼠 IgG抗體之間可變區的氨基酸序列差異很小，由於酸性和鹼性氨基酸以及末端羧基和氨基的存在， 重鏈和輕鏈、正電荷和負電荷在抗體上分布不均，決定了整個抗體(Fab)2和Fc片段的等電點。(Fab)2片段的等電點通常最大，Fc片段的等電點最小，相差約1~2。(Fab)2片段中鹼性氨基酸的數量遠多於酸性氨基酸的數量，而Fc片段中兩者則幾乎相等。(Fab)2片段的淨電荷絕對值大於Fc片段，即使在鹼性環境下整個抗體的淨電荷為負，(Fab)2片段仍帶正電荷，影響抗體的吸附。因此，靜電引力對帶正電的(Fab)2片段和帶負電的納米球之間的相互作用起主導作用。鹼性環境下，(Fab)2片段帶正電，而Fc片段帶負電，前者優先吸附到納米球上。而且Fab末端伯氨基的去質子化比賴氨酸側鏈的去質子化更加完全，並且這些伯氨基更容易與羧基綴合，易導致不理想的抗體偶聯取向。酸性條件下，Fab末端的大部分氨基質子化，其交聯優先級降低。另外由於Fc區淨電荷較小，疏水性變強，更有可能通過疏水相互作用結合納米球。由於較高的質子化削弱了氨基的反應性，隨著反應pH值的降低，抗體的交聯速率則隨之降低，交聯速度的降低也提供抗體在吸附後、形成共價鍵前提供了窗口時間，以充分調整其方向。[5]
儲存
[編輯]膠乳儲存體系中，甘氨酸和精氨酸分子作為添加劑，可能可以通過與蛋白質內部非極性部分直接相互作用，增加蛋白質的溶解度而不降低穩定性。另外，甘氨酸作為一種兩性離子，能夠通過其帶負電和帶正電的基團與蛋白質相互作用，並且由於其尺寸小，因此不會受到空間阻礙而與蛋白質的多個部分結合。單獨使用甘氨酸添加劑對蛋白表現出兩個穩定階段：濃度低於 100 mM時是蛋白質特異性的，可能由於與極性或帶電側鏈以及蛋白質肽主鏈上的部分電荷產生多重直接相互作用所致；濃度高於100 mM則類似於高電荷密度陰離子，產生了蛋白和共溶質之間對水的競爭作用。[6]
一般來說，對於pH值遠離等電點（pI 值）的水溶液中的蛋白質，由於靜電斥力，pH成為決定膠體穩定性的主要因素。溫度對膠乳儲存緩衝液的影響也值得注意，因為電離程度會隨着溫度的變化而變化，因此緩衝液的pH值會隨着樣品的冷卻或加熱而變化。在室溫下測量的系統pH值可能不是在 2-8°C下儲存時的準確pH值，特別是N基的緩衝液如HEPES等，會表現出這種隨溫度變化pH的行為。磷酸鹽還可以提高蛋白在含NaCl溶液中的熱穩定性，可能是通過磷酸鹽離子直接與蛋白質結合而實現。對於IgG抗體而言，相比磷酸和檸檬酸，MES可以最有效降低蛋白聚集。磷酸鹽和檸檬酸鹽可能導致蛋白熱變性不可逆，而與此相比，咪唑和Tris可顯著增強熱變性的可逆性，另外緩衝鹽濃度降低也有助於提高蛋白熱變性的可逆性。[7]
如果膠乳表面抗體之間的空間足夠大，抗體將在老化過程中繼續演化為「平接（flat-on）」朝向。[5]
應用
[編輯]凝集技術用於檢測針對多種病毒和細菌產生的抗體，以及自身免疫性疾病中針對產生的自身抗體。例如，可以檢測風疹病毒、輪狀病毒和類風濕因子，並且可以進行出色的隱球菌LA 檢測。 [8]凝集技術也用於A型鏈球菌感染的明確診斷。
影響因素
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膠乳凝集實驗的可信度和靈敏度取決於許多因素，包括： 聚合物膠乳尺寸、表面電荷、親疏水性、可能與蛋白反應的官能團； 吸附條件，決定抗原抗體附着量和方式；凝集條件（pH、離子強度、溶解離子性質、溫度、脫水劑等）；用於測定的光學技術等。在這之中，最重要的參數可能與膠乳穩定性有關，這是這種分析系統的基石。抗體包被膠乳在沒有抗原的情況下必須完全穩定，聚集過程只能由特定抗原觸發，而不應由反應介質的物理化學條件（主要是 pH 和離子強度）觸發。 否則會出現假陽性，導致誤診。[2]
蛋白質-乳膠系統主要是疏水性的，因此它們的穩定性可用Derjaguin、Landau、Verwey和Overbeek開發的稱為DLVO理論的膠體穩定性理論模型來描述。該方法考慮兩個球形粒子之間的總相互作用勢 (VT)，該相互作用勢取決於兩項：第一項是由靜電力產生的排斥勢（VE），排斥相互作用主要取決於各個雙層的動電勢； 第二個是吸引力產生的勢（VA），與倫敦-范德華分散力（London–van der Waals' dispersion forces）有關。[2]
膠乳表面性質
[編輯]聚合物微球通常用作各種免疫測定和測試的基礎。 這些顆粒的大表面積/體積比使其適合進行抗體吸附。其表面的電荷密度、官能團類型和疏水特性（以及介質pH值和離子強度）特徵是控制吸附蛋白質的數量和方向以及蛋白質穩定性的最重要參數。由於粒子聚集通過光學檢測，隨着樣品光學特性變化，膠乳顆粒尺寸對於免疫凝集過程中這些特性變化的速度至關重要。一方面，尺寸成為粒子合成過程中需要控制的重要參數；另一方面，顆粒的一些表面特性也很重要，因為它們影響膠體體系的最終穩定性和抗體吸附模式（主要是固定化抗體的吸附量和方向）。這些特性是表面電荷密度、親水/疏水特性以及表面化學基團的性質及其共價偶聯蛋白質分子的能力。[2]
相關
[編輯]參考
[編輯]- ^ 抗原检测. www.coagulationassays.com. [2023-09-07]. （原始內容存檔於2023-09-07） （阿爾巴尼亞語）.
- ^ 2.0 2.1 2.2 2.3 Ortega-Vinuesa, J. L.; Bastos-González, D. A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 2001-01, 12 (4) [2023-09-03]. ISSN 0920-5063. doi:10.1163/156856201750195289. （原始內容存檔於2023-09-03） （英語）.
- ^ Sturgeon, Catharine M; Viljoen, Adie. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Annals of Clinical Biochemistry: International Journal of Laboratory Medicine. 2011-09, 48 (5) [2023-09-13]. ISSN 0004-5632. doi:10.1258/acb.2011.011073. （原始內容存檔於2022-06-29） （英語）.
- ^ Gao, Shipeng; Guisán, José M.; Rocha-Martin, Javier. Oriented immobilization of antibodies onto sensing platforms - A critical review. Analytica Chimica Acta. 2022-01-02, 1189 [2023-11-04]. ISSN 0003-2670. doi:10.1016/j.aca.2021.338907. （原始內容存檔於2023-11-04）.
- ^ 5.0 5.1 5.2 Lou, Doudou; Ji, Lu; Fan, Lin; Ji, Yongxin; Gu, Ning; Zhang, Yu. Antibody-Oriented Strategy and Mechanism for the Preparation of Fluorescent Nanoprobes for Fast and Sensitive Immunodetection. Langmuir. 2019-04-09, 35 (14) [2023-11-07]. ISSN 0743-7463. doi:10.1021/acs.langmuir.9b00150. （原始內容存檔於2023-11-07） （英語）.
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- ^ Howanitz and Howanitz, Laboratory Medicine. Published by Church Livingston; 1991: pp 825–828
外部連結
[編輯]- 醫學主題詞表（MeSH）：Latex+fixation+test
- Singer JM, Edberg SC, Selinger M, Amram M. Quality control of the latex-fixation test. Am. J. Clin. Pathol. 1979, 72 (4): 591–6. PMID 495562. doi:10.1093/ajcp/72.4.591.
- Description of the test （頁面存檔備份，存於網際網路檔案館）