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TA克隆

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Diagram of TA Cloning.
TA克隆的图示

TA克隆(TA cloning)是一种免用限制酶亚克隆手段[1],其操作不仅比传统的亚克隆简单,而且耗时也较短。TA克隆的关键在于载体和目的基因末端的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的互补配对。载体和目的基因进行上述配对之后,用DNA连接酶即可实现它们之间的共价连接。

过程

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制造目的基因

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一般用PCR来制造目的基因。PCR中所用的Taq酶无3'-5'端外切活性,容易在3'端额外加上一个腺嘌呤(A)。因而PCR产物两条链3'端一般都多出一个腺嘌呤。如果PCR引物的5'端含有鸟嘌呤(G)的话,能使得3'端加上腺嘌呤的几率最大化[2]。值得注意的是,制造用于TA克隆的目的基因的DNA聚合酶不能有3'-5'外切活性,否则产物的3'端不会多出一个额外的腺嘌呤[3]

制造载体

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首先,将想要使用的载体用能产生平滑末端的限制酶线性化。之后,用末端转移酶在其末端加上一个2',3'-双脱氧三磷酸胸苷(ddTTP)。使用ddTTP才能确保只在末端加上一个胸腺嘧啶残基。胸腺嘧啶残基会被加到3'端上[4]。一般市面上的TA克隆试剂盒中会附有一系列的可直接用于TA克隆(即3'端有一个额外的胸腺嘧啶)的载体。

优缺点

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TA克隆中除了切开载体之外,都不需要使用限制酶,因而其操作相比传统亚克隆手段更简单快速。实验者也没有必要在设计引物的时候加上限制酶位点,因而节约了时间和金钱。另外,如果因为没有合适的酶切位点而无法进行传统的亚克隆时,TA克隆就可以作为一种替代方案。TA克隆的主要缺陷在于目的基因有50%的概率以相反方向被植入载体中[1]。此外,通常情况中,TA克隆中的目的基因末端会多出一个腺嘌呤,而载体末端会多出一个胸腺嘧啶。

参见

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参考

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  1. ^ 1.0 1.1 Improved TA Cloning. Caister Academic Press. [2009-10-17]. (原始内容存档于2011-07-08). 
  2. ^ TA cloning protocol. Durham, New Hampshire, USA: Hubbart Center for Genomic Studies. [2009-10-17]. (原始内容存档于2008-12-02). 
  3. ^ TA Cloning Kit Manual (PDF). Invitrogen: 31. 7 April 2004 [2009-10-17]. (原始内容 (PDF)存档于2010-06-24). 
  4. ^ Holton, T.A.; Graham, M.W. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Research. 1991-03-11, 19 (5): 1156. PMC 333802可免费查阅. PMID 2020554. doi:10.1093/nar/19.5.1156.